Denne side er et supplement til
**BioNyt – Videnskabens Verden** nr.158

Du kan tegne abonnement på BioNyt: Videnskabens verden **her!**

Køb dette nr.

SPØRGSMÅL OG SVAR OM PCR-teknologien Supplement til BioNyt Videnskabens Verden nr. nr.72 og 158

Læs hele artiklen om PCR i BioNyt Videnskabens verden, nr.158

Hvad er PCR-metoden?

I 1980’erne blev der opfundet en PCR-teknologi (polymerase chain reaction), som var meget mere følsom end den hidtidige analysemetode, ELISA-metoden. Det grundlæggende princip ved PCR er beskrevet udførligt i BioNyt nr. 72(ref.10702).

PCR-teknikken bygger på opformering af det bestemte område af det genetiske materiale, DNA, som man ønsker at påvise i en biologisk prøve. (DNA-området kan f.eks. indeholde en basesekvens, der kendetegner en genetisk sygdom, eller som stammer fra et virus eller en parasit). Kopieringen af dette DNA går lynhurtigt ved hjælp af PCR-metoden: På få timer kan man få rigeligt med DNA til nærmere undersøgelser.

Ved PCR-metoden kræves meget lidt DNA som udgangspunkt, fordi opformeringen af det valgte DNA-stykke er så præcis. Dette er basis for metodens anvendelighed. For at undgå forurening med andre DNA-sekvenser, er det imidlertid nødvendigt, at processen forløber afskærmet fra omgivende forureningskilder. PCR i korte træk: Trin 1: Kraftig opvarmning til ca. 95°C i 1-2 minutter. (Det dobbeltstrengede DNA adskilles derved). Trin 2: Temperaturen sænkes langsomt til 55°C i 2 minutter. (Der tilføres to PCR-primere, som er fremstillet til specifikt at binde til det styk­ke DNA, der skal kopieres, ”mål­sekvensen”). Der er to primere, fordi de bindes til hver af de to strenge i DNA, se figuren overfor. Trin 3: Temperaturen hæves til 72°C. (DNA-syntesen sættes i gang med enzymet DNA-polymerase, der kan tåle denne høje temperatur. DNA-polymerase-enzymet kan kun påsætte deoxyribonukleotider på enden af PCR-primeren. Derfor starter kopieringen kun ved målsekvensen).

Ved at gentage processen 20-40 gange, dannes flere og flere mål­sekvenser, som efterfølgende kan bestemmes.

Hvilke begrænsninger har DNA-polymeraseenzymet i PCR-teknologien?

DNA-polymeraseenzymet , der bruges ved PCR-metoden, har to vigtige begrænsninger: Enzymet kan ikke selv starte DNA-syntesen (men skal have en primer-ende; 3’OH), og enzymet kræver en skabelon i form af den anden DNA-streng. Disse to krav sikrer, at man kan opformere målsekvensen på en specifik måde (ref.10702).

Hvilke krav stiller PCR-metoden?

PCR-metoden stiller særlige krav til analyseudstyr og uddannelse af personalet. Metoden er omstændelig at udføre på grund af de gentagne temperaturskift, og der er risiko for opformering af ikke-relevant nukleinsyre. PCR-metoden er af disse grunde ikke blevet udbredt uden for specialiserede laboratorier.

Hvad er PCR-teknologiens afløser?PCR-teknologiens afløser er RCA-metoden. PCR-metoden kræver som nævnt, at temperaturen styres, og hele tiden veksler mellem 95°C / 55°C / 72°C. Det kan ganske vist automatiseres, men kræver laboratorieudstyr.

Fremgang for RCA-analysen Vadim V. Demidov opsummerede i 2005, hvordan ti-året 1995-2005 var gået med hensyn til analyser inden for DNA-diagnostik (ref.10708). I 2005 var PCR stadig den dominerende analyse­metode ved DNA-diagnostik. Men PCR var ved at blive indhentet af de metoder, som ikke kræver opvarmning i løbet af analyseprocessen – og især RCA-metoden var blevet mere og mere populær.

Når man ønsker at måle små mængder af et genprodukt, har det været almindeligt at bruge en kvantitativ PCR-reaktion, fordi PCR-teknologien kan måle små mængder. Men PCR-teknologien er som tidligere nævnt en kompleks teknologi, og den måler kun oligonukleotider (f.eks. mRNA) og ikke enzymaktiviteter.

Ved hjælp af PCR-metoden kan man f.eks. måle den mængde mRNA, der koder for et enzym, men man er ikke i stand til at måle, om enzymet er i en aktiv, dvs. katalyserende, form.

I mange tilfælde er man netop mest interesseret i at måle selve enzym­aktiviteten.

Hvor billige kan PCR-maskiner være?

I Holland har man udviklet en qPCR-maskine i skotøjsæske-størrelse til ca. 1500 kr. Apparatet hedder Amplino. Den kan ud fra en blodprøve påvise malaria, endog parasit-stammen. Hver prøve koster 5-6 kr. Apparatet skal afprøves i Zambia. For brugeren er testen simpel: Et prik i fingeren, bloddråben opsuges med en strimmel, som indsættes i apparatet og 20 minutter efter aflæses resultatet.

Apparatet har brug for enzymer, DNA-byggesten og korte DNA-stykker, som parres med malaria-DNA'et. DNA-proberne afgiver et fluorescerende signal, når de finder malaria-DNA. Der kan anvendes forskellige DNA-prober for hver malaria-stamme, og farvesignalet kan være forskelligt, så malaria-stammen også kan aflæses. Opkobling til Internettet muliggør cloud-dataindsamling og GPS-lokalisering, som viser smitteforekomsten i landet.

Ved de nuværende metoder til påvisning af malaria (mikroskopi eller hurtigtest-kit) bliver nogle smittede ikke diagnosticeret og malaria-stammen bliver ikke bestemt.

Det billige PCR-apparat vil også kunne udvikles til påvisning af bakterier og virus, bl.a. HIV.